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離心原理

當(dāng)含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場

動的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且又與重力場的強度及液體的粘度有關(guān)。像紅血球大小的顆粒，直徑為數(shù)微米，就可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。

此外，物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時還伴隨有擴散現(xiàn)象。擴散是無條件的的。擴散與物質(zhì)的質(zhì)量成反比，顆粒越小擴散越嚴(yán)重。而沉降是相對的，有條件的，要受到外力才能運動。沉降與物體重量成正比，顆粒越大沉降越快。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等，它們在溶液中成膠體或半膠體狀態(tài)，僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的。因為顆粒越小沉降越慢，而擴散現(xiàn)象則越嚴(yán)重。所以需要利用離心機產(chǎn)生強大的離心力，才能迫使這些微?？朔U散

產(chǎn)生沉降運動。

離心就是利用離心機轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開。離心力(F)的大小取決于離心轉(zhuǎn)頭的角速度(ω，r/min)和物質(zhì)顆粒距離心軸的距離(r，cm)。它們的關(guān)系是：F=ω2R [1]

為方便起見，F(xiàn)常用相對離心力也就是地心引力的倍數(shù)表示。即把F值除以重力加速度g (約等于9.8m/s2.)得到離心力是重力的多少倍，稱作多少個g。例如離心機轉(zhuǎn)頭平均半徑是6cm，當(dāng)轉(zhuǎn)速是60 000r/min時，離心力是240 000×g，表示此時作用在被離心物質(zhì)上的離心力是日常地心引力的24萬倍。

用離心方法分離生物大分子和亞細胞物質(zhì)的基本原理是根據(jù)它們在液體介質(zhì)中或者沉降速度不同而形成不同的區(qū)帶，或者它們的密度不同而停留在液體介質(zhì)中不同的位置而把它們一一分開。前者是沉降速度法，應(yīng)用該法時液體介質(zhì)的大密度要小于樣品中小顆粒的密度，離心時選用高轉(zhuǎn)速和短時間；后者是沉降平衡法，應(yīng)用該法時液體介質(zhì)的大密度要大于樣品中小顆粒的密度，離心時選用較低轉(zhuǎn)速和較長時間。實際操作有幾種形式：

差速離心

這種方法是選擇不同轉(zhuǎn)速的離心，分別分離各個不同組分。例如先用低速沉降大顆粒和上清液，在高速離心上清沉降中等顆粒，后超速離心上清沉降小顆粒。采用逐級提高離心力分離上情液的方法，把不同大小的顆粒分開。

這種方法比較簡單，方便。分離的組份沉到管底，因此可以迅速濃縮所要的組份，減少體積。但回收率和純度是有矛盾的，要提高回收率，勢必提高轉(zhuǎn)速或延長離心時間，這樣大小相近的顆粒也會沉到管底。因此該法多用于粗提純或初步濃縮樣品。

速度區(qū)帶(或速度梯度)離心

本法是將樣品放在一個連續(xù)的密度梯度液體上，通過離心，大顆粒沉降快，小顆粒沉降慢。經(jīng)過一段時間，相同的顆粒就在同一深度

形成一條帶子，因此把各種組份分開來。它適用于分離密度相同、而大小不同的物質(zhì)，如不同的蛋白質(zhì)組份密度都差不多，但分子量不一樣，用本法很容易將其分開。但對密度不同、大小類似的物質(zhì)則不易分離。

蔗糖梯度是一種常用的介質(zhì)。用不同濃度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度，用于梯度離心。再分別進行收集處于不同區(qū)帶里的各個組份。

沉降平衡離心

這是靜力學(xué)的方法。在離心管中形成一個液體梯度，在離心時各組份以不同的速度下沉，但終停留在與自己相同的密度中，形成一條狹窄的平衡帶，并保持相對的穩(wěn)定。為了使樣品所有組份都能達到它們的平衡位置，需要長時間離心。這種方法適用于分離大小相似但密度不同的物質(zhì)，如核酸的分離。氯化銫梯度是常用于平衡離心的介質(zhì)，分辨率很高，可區(qū)別密度相差0.05的組分，但離心時間需十幾到幾十小時，且價格很貴。已有一種商品名叫"Percoll"的聚蔗糖溶液可以代替氯化銫梯度。該介質(zhì)能迅速形成梯度，使離心時間大大縮短到1-2h而仍有很好的分離效果。并且有配套的標(biāo)記珠 可以測定樣品的密度。